一、地高辛标记探针的方法
地高辛（Digoxigenin，Dig），又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。通过人工方法可以将Dig经由一个11个原子的线型间隔臂连接到脲嘧啶的C5位置，形成Dig-dUTP。地高辛标记DNA探针的方法主要有PCR法、随机引物法以及切口平移法。地高辛标记寡核苷酸探针的方法有3'末端标记法、5'末端标记法以及在探针3'端加上数个DIG-dUTP分子的加尾法。标记RNA探针的方法主要是通过RNA聚合酶SP6、T7或T3经体外转录将地高辛标记于RNA探针上。
制备出的地高辛标记探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southern blotting）、DNA-RNA杂交（Northern blotting）、斑点杂交（Dot blotting）、克隆杂交、原位杂交、菌落杂交、文库筛选及酶联免疫分析（ELISA）。杂交的地高辛探针可以由抗地高辛抗体来检测，这个抗体一般会与碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素或胶体金偶连。
二、地高辛标记试剂盒的选择标准
1、Dig-dUTP与未标记核苷酸搭配比例是否最优化
Dig-dUTP与未标记核苷酸的搭配比例很重要，因为在使用地高辛抗体进行含Dig的杂交体检测时，探针上插入的Dig分子需排布在一个合适的空间位阻范围，以利于抗体的顺利结合，并获得高灵敏度的检测信号。
我们实验室分别用了BIOG和知名品牌X的地高辛标记试剂盒标记5ng Hela细胞DNA，5倍稀释PCR产物，点样于尼龙膜，再以NBT/BCIP进行检测，同等检测条件下，点样量低至0.1pg，BIOG地高辛标记试剂盒制备的探针仍可被有效地检测出来，而X品牌试剂制备的探针无法被检测出来。可见，BIOG地高辛标记试剂盒的标记效率明显高于品牌X，说明BIOG中Dig-dUTP与未标记核苷酸的搭配比例更加理想，能够使Dig-dUTP能够较大程度地掺入PCR产物中。
2、标记探针的特异性是否强
性能好的地高辛标记试剂盒在标记探针时具有较强的特异性，能极大程度的减少因引物模板错配以及引物二聚体形成等导致的非特异性标记，从而提高实验结果的准确性。据了解，为数不多的地高辛标记试剂盒中，BIOG品牌的试剂盒内配备了超级热启动Taq酶，这种酶由于经过了严格的化学封闭，在室温下完全没有活性，这样就避免了在加样、升温等阶段容易出现的非特异性扩增和引物二聚体产生，因而可以制备出高度标记、非常特异且十分灵敏的杂交探针。
3、合成的探针产量是否大
为了在后续的杂交实验中添加一定数量的探针，必须在地高辛标记反应中产生足够量的Dig标记探针。如果合成出的探针产量低，往往会对后续杂交实验的效果产生影响。利用PCR法制备地高辛标记探针相比于其他方法可获得更高浓度的探针，且产量也更大。尤其是在模板量有限量的情况下，更推荐科研工作者选择PCR法制备地高辛标记探针。目前，市面上主要有Roche和BIOG两个品牌的PCR法地高辛标记试剂盒，这两款产品的性能都非常不错，哪怕是非常微量的模板，也能制备出大量的高活性的地高辛标记探针。就我们曾经的实验数据来看，取5ng Hela细胞基因组DNA为模板，使用BIOG地高辛标记试剂盒标记GAPDH，就可以制备出高达1ug较纯的均质化的GAPDH探针。
