从T25种24孔板，细胞量是10倍。
2ml吹悬，取其中1ml，加入5ml液体，已经稀释10倍。
每个孔种20%，20ul3， 50ul3，100ul3，200ul3铺板。

细胞生长到30-50%密度

• 使用小圆形细胞专用爬片玻璃片，放置于浓硫酸中浸泡 12 小时, ddH2O 水冲洗
  10 次，再用酒精浸泡 8 小时，ddH2O 冲洗 10 次（如果冲洗不净的话，细胞爬片固
  定效果不佳）。将饭盒底部铺好纱布，将玻璃片轻轻放置于纱布上面，单层放置，
  在单层玻璃片上再放置一层纱布，再铺上单层玻璃片，依次每侧纱布间放置一层玻
  璃片（如果不单层放置玻璃片高压后易粘连）。将饭盒放置高压锅中高压灭菌，随
  后放于烘干箱中烘干水分。将玻璃片的饭盒开盖放入超净台，紫外照射 30 分钟，确
  保玻璃片无菌。将夹起的玻璃片放入无菌 PBS 中，紧接着放入培养板中，湿润的玻
  璃片可以使得片子和培养孔板的底壁紧密相粘，有利于细胞在片子上面贴壁。细胞
  瓶中的细胞经过胰酶消化后，离心重悬于完全培养基中，计数后根据数目计算好合
  适的细胞密度接种于孔板中。一段时间培养后，在显微镜下观察细胞爬片的密度和
  细胞形态，取出玻璃片。
• 先用 PBS 清洗玻璃片，清洗 3 遍每次 5 分钟。配制 4%多聚甲醛，加入多聚甲
  醛浸没细胞爬片，固定细胞 30 分钟。弃去多聚甲醛，取出要使用的细胞爬片，其余
  的爬片于-20°C 冰箱储存。将细胞爬片放入废弃的十二孔板中，加入 PBS 冲洗。滴
  加过氧化酶阻断剂浸没玻璃片，37°C 孵育 30 分钟。PBS 冲洗后，加入非免疫性动
  物血清封闭，37°C 孵育 30 分钟。取出片子后 PBS 配制的合适稀释浓度的一抗孵育，
  湿盒放置 4°C 冰箱过夜。次日 PBS 冲洗后，加入山羊抗鼠/兔 IgG 二抗，37°C 孵育
  30 分钟。PBS 冲洗后，滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，37°C 孵育 30 分钟。
  PBS 冲洗后，配制 DAB 工作液，在显微镜下在片子上滴加 DAB 试剂显色，固定的
  染色时间后放入自来水中终止显色。苏木素复染 5 分钟，放入自来水中冲洗，流水
  速度调到最小，切记对着片子直接冲洗，防止脱片。在载玻片上滴加甘油，将爬片
  倒置于甘油上方封片，小心气泡。
  使用 PBS 代替一抗作为空白对照，同型的兔或小鼠 IgG 代替一抗作为阴性对
  照。观察结果：以细胞膜、细胞浆呈现的棕黄色着色为阳性。根据着色强度标记为
  无着色、浅黄色、棕黄色和棕褐色，分别记分为 0、1、2 及 3 分;着色细胞所占视野的百分比<5%，6%_25%，26%50%，51%~75%及>75%，分别记为 0、1、2、3、4
  分。两项相乘得到最后评分:0~2 分为(-)、3~4 分(+)5~8 分 (++)9~12 分 (+++)。由两
  位观察者分别阅片控制误差。